pcr引物设计_pcr引物设计时不需要考虑

【科研】PCR引物设计原则

① 特异性：引物应在保守区内设计并具有特异性，引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

pcr引物设计_pcr引物设计时不需要考虑

pcr引物设计_pcr引物设计时不需要考虑

② 引物长度： 一般在15~30碱基之间 ，引物有效长度Ln=2(G+C)+A+T，Ln值不能大于38。（Ln>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度74℃，不能保证产物的特异性）

③ 目的片段二级结构：要扩增的片段单链不能形成二级结构，扩增片段长度为100~600碱基对。

④ 引物二级结构：引物自身连续互补碱基不能多于3bp，一对引物间连续碱基的同源性或互补性不能多于4bp。

⑤ 引物的5′端：可以被修饰而不影响扩增的特异性。5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点；插入与缺失突变序列和引入启动子序列等。

⑥ 引物的3′端： 不能进行任何修饰，3′端也不能有形成任何二级结构的可能 ，引物3′端不要终止于密码子的第3位。

⑦ TM值：按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为50~70℃。 尽可能保证上下游引物的Tm值一致 ，一般不超过 2℃。若引物中的 G+C 含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。退火温度约为TM-4。

⑧ GC含量：G+C含量在40%~60%之间。四种碱基的分布随机，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。

引物的设计一般要考虑以下几个问题：

1.

长度

，至少要16bp，通常为18-30bp

2.解链温度（Tm值）

3.避免引物

内部

或引物之间存在互补序列（3个碱基），从而减少

引物二聚体

的形成以及引物内部

二级结构

的形成

4.G+C含量尽量控制在40%-60%之间。4钟碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免

嘌呤

或嘧啶

的连续排列，以及T在3'末端的重复排列

5.引物的3'末端是G或C，但不要GC连排

实时定量的引物设计要求比较高，可以按普通引物设计的方法来做，但是设计时要注意扩增的片段不能太大，在bp-100bp之间。同时要保证这对引物有的特异性，因为要是产生非特异性扩增的话，就不能准确的计量模板量了，这样就失去了实时定...

NF-KBmRNA不就是NF-KB的mRNA么 做定量PCR就是测它mRNA的表达量啊 NF-KBP65是NF-KB3 NF-KBP52是NF-KB2 所以这两个还是有区别的 如果你是要检测65的话

建议你还是选择CDS区不一样的地方设计引物吧，这样可以避免交叉污染引起的非特异扩增，扩增的序列长度不一定要一样，每个引物你设计两三对，然后做一个相对定量看看不同引物的扩增效率，选择比较好的两对引物做后续试验，内参基因的引物不需...

实时定量的引物设计要求比较高，可以按普通引物设计的方法来做，但是设计时要注意扩增的片段不能太大，在bp-100bp之间。同时要保证这对引物有的特异性，因为要是产生非特异性扩增的话，就不能准确的计量模板量了，这样就失去了实时定...

若是根据已知序列扩增未知物种的相应序列，可以根据先根据已知序列进行blast搜索，发现其他同源序列，保存后进行比对，找出其中较保守区域，并根据primer或oligo等软件对某条序列进行分析，搜索其中适合做引物的片段，并人工修正不合适部分。也可以设计成兼并引物。

如果已经获得序列，只是需要设计引物将其中某段扩增出来，相对就简单些了，可以直接用上述软件进行设计就可以了。

当然，实际作起来还要看运气啦。------更多交流，西部生命科学

引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；

引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

引物所对应的模板序列的Tm值在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；

ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0。

PCR引物的设计原则

引物应用系列保守区内设计并具有 特异性。

产物不能形成 二级结构。

引物长度一般在15~30 碱基之间。

G+C含量在40%~60%之间。

碱基要随机分布。

引物自身不能有连续4个 碱基的互补。

引物之间不能有连续4个 碱基的互补。

引物5′端可以修饰。

引物3′端不可修饰。

引物3′端要避开密码子的第3位。

1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；

2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所对应的模板序列的Tm值在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；

4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；

5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；

6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；

7、引物二聚体及发卡结构的能量的一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；

8、3'端不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端一个碱基不要是A或T，若是，会导致错配；

9、以公式Tm=4（G+C）+2（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；

10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；

11、在DNA测序和PCR中用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除引发反应；

12、引物和产物之间的Tm值相别太大，20摄氏度范围内。

13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。

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PCR引物是在进行PCR扩增的原料，它的组成是需扩增的DNA链的一部分碱基的互补配对。所以，设计PCR引物就是要扩增的DNA的起始的一部分碱基的片段。

用引物设计软件Primer 来设计